12.9 DÇu bÐo

 

Tạp chất kiềm

Trộn 10 ml aceton (TT) và 0,3 ml nước trong ống nghiệm, thêm 0,05 ml dung dịch xanh bromophenol 0,04% trong ethanol 96% (TT), trung hoà dung dịch nếu cần bằng dung dịch acid hydrocloric 0,01M (TT) hoặc dung dịch natri hydroxyd 0,01M (TT). Thêm vào 10 ml dầu, lắc và để lắng. Không dùng quá 0,1 ml dung dịch acid hydrocloric 0,01M (CĐ) để làm chuyển màu lớp dung dịch phía trờn sang màu vàng.

 

Định tính dầu béo phương pháp sắc ký lớp mỏng

Tiến hành theo phương pháp Sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4), sử dụng chất hấp phụ là octadecylsilyl silicagel cho sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (Merck HPTLC silica gel RP-18 là phù hợp).

Dung dịch 1: Hoà tan khoảng 20 mg (1 giọt) dầu trong 3 ml dicloromethan (TT), trừ khi có chỉ dẫn khác.

Dung dịch 2: Hoà tan khoảng 20 mg (1 giọt) dầu ngô trong 3 ml dicloromethan (TT)

Chấm riêng biệt lên bản mỏng 1ml mỗi dung dịch trên. Triển khai sắc ký hai lần, mỗi lần 0,5 cm với dung môi khai triển là ether (TT). Triển khai sắc ký hai lần nữa, mỗi lần 8 cm với dung môi khai triển là hỗn hợp dicloromethan – acid acetic băng – aceton (20 : 40 : 50). Để khô bản mỏng ngoài không khí và phun dung dịch acid phosphomolybdic (TT) 10% trong ethanol 96% (TT). Sấy bản mỏng 120 ⁰C trong khoảng 3 phút và quan sát dưới ánh sáng tự nhiên. Sắc ký đồ xuất hiện các vết đặc trưng như trên hình dưới đây.

 

 

1. DÇu l¹c 2. DÇu võng 3.  DÇu ng« 4. DÇu h¹t c¶i (kh«ng cã acid erucic) 5. DÇu ®Ëu t­¬ng. 6. DÇu h¹t c¶i

7. DÇu h¹t lanh 8. DÇu oliu 9. DÇu h­íng d­¬ng 10. DÇu h¹nh nhân 11. DÇu mÇm lóa m×

 

Hình 12.9: Sắc ký đồ định tính dầu béo.

 

Phép thử các dầu khác nhau bằng sắc ký lớp mỏng

Tiến hành theo phương pháp Sắc ký lớp mỏng (Phụ lục 5.4), sử dụng chất hấp phụ là kieselguhr G (TT). Làm ẩm bản mỏng khô bằng cách đặt trong bình có lớp dung môi dày 5 mm là hỗn hợp parafin lỏng – ether dầu hoả (điểm sôi 50  - 70 ^oC) (10 : 90). Để đến khi dung môi khai triển được ít nhất 12 cm, lấy bản mỏng ra và để khô ngoài không khí trong 5 phút. Sử dụng hỗn hợp nước – acid acetic băng (1 : 9) làm dung môi khai triển sắc ký và tiến hành triển khai sắc ký khoảng 8 cm tính từ điểm chấm. Chấm riêng biệt lên bản mỏng 3 ml mỗi dung dịch sau:

Dung dịch (1): Đun hồi lưu 2 g dầu với 30 ml dung dịch kali hydroxyd 0,5 M trong ethanol (TT) trong 45 phút, pha loãng với 50 ml nước, để nguội, chuyển sang bình gạn, lắc với ether ethylic (TT) 3 lần, mỗi lần 50 ml, loại bỏ lớp dịch chiết ether. Acid hoá lớp nước bằng acid hydrocloric (TT) rồi chiết bằng ether ethylic (TT) ba lần, mỗi lần 50 ml. Tập trung các dịch chiết ether, rửa bằng nước ba lần, mỗi lần 10 ml, làm khan dịch chiết ether bằng natri sulfat khan (TT) và lọc. Cô dịch chiết ether trên cách thuỷ, hoà tan 40 mg cắn trong 4 ml cloroform (TT). Các acid béo có thể được phát hiện từ dung dịch đã xà phòng hóa trong quá trình xác định các chất không xà phòng hoá. 

Dung dịch  (2): Chuẩn bị giống như dung dịch 1 nhưng dùng 2 g hỗn hợp gồm 19 thể tích dầu ngô và 1 thể tích dầu hạt cải thay cho mẫu thử. Sau khi lấy bản mỏng ra khỏi bình, làm khô bản mỏng ở 110 ^oC trong 10 phút và trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận, đặt bản mỏng vào bình bão hoà hơi iod. Sau một thời gian, xuất hiện các vết từ màu nâu đến nâu vàng. Lấy bản mỏng ra, để yên vài phút cho đến khi màu nâu trên nền bản mỏng biến mất. Phun lên bản mỏng dung dich hồ tinh bột (TT). Các vết màu xanh xuất hiện, các vết này có thể chuyển thành màu nâu khi để khô và lại chuyển thành màu xanh sau khi phun nước. Trên sắc ký đồ của dung dịch (1) luôn xuất hiện các vết với các giá trị R_f khoảng 0,5 (acid oleic) và khoảng 0,65 (acid linoleic), tương ứng với các vết trên sắc ký đồ của dung dịch (2). Trên sắc ký đồ của dung dịch (1) có thể có vết với giá trị R_f khoảng 0,75 (acid linolenic) nhưng không được có vết có giá trị R_f khoảng 0,25 (acid erucic), tương ứng với vết xuất hiện trên sắc ký đồ của dung dịch (2).

 

Phép thử các dầu tạp bằng phương pháp  sắc ký khí

Phép thử các dầu tạp được xác định bằng phương pháp sắc ký khí (Phụ lục 5.2), dựa trên các methyl ester của acid béo có trong dầu béo.

 

Phương pháp A

Phương pháp này  không áp dụng với các dầu béo có chứa acid béo dạng glycerid với các nhóm epoxy-, hydroepoxy-, cyclopropyl hoặc nhóm cyclopropenyl, hoặc các dầu béo có chứa tỷ lệ lớn lượng acid béo có chuỗi carbon nhỏ hơn 8 hay dầu béo có chỉ số acid lớn hơn 2,0.

Dung dịch thử: Nếu có qui định trong chuyên luận, làm khan  dầu béo thử trước giai đoạn methyl hoá. Cân 1,0 g dầu vào bình đáy tròn 25 ml có cổ bình thuỷ tinh nối được với ống sinh hàn hồi lưu, cho vài viên đá bọt vào trong bình. Thêm 10 ml methanol khan (TT) và 0,2 ml dung dịch kali hydroxyd 6% trong methanol. Lắp sinh hàn hồi lưu, cho khí nitơ chạy qua hỗn hợp với tốc độ khoảng 50  ml/phút, lắc và đun sôi. Khi dung dịch trở nên trong suốt (thường sau khoảng 10 phút), tiếp tục đun trong 5 phút. Làm nguội bình dưới dòng nước và chuyển dung dịch sang bình gạn. Rửa bình bằng 5 ml heptan (TT) và chuyển dịch rửa vào bình gạn, lắc. Thêm 10 ml dung dịch natri clorid 20% và lắc mạnh. Để yên cho tách lớp và chuyển lớp dung môi sang lọ có chứa natri sulfat khan (TT).  Để lắng và lọc.

Dung dịch đối chiếu (a): Chuẩn bị 0,50 g hỗn hợp chuẩn với thành phần được mô tả ở một trong các bảng 12.9 như chỉ dẫn của chuyên luận riêng (nếu chuyên luận riêng không đề cập đến, sử dụng thành phần được miêu tả trong bảng 12.9.1). Hoà tan trong heptan (TT) và pha loãng đến 50 ml với cùng dung môi.

Dung dịch đối chiếu (b): Pha loãng 1 ml dung dịch đối chiếu (a) thành 10 ml bằng heptan (TT).

Dung dịch đối chiếu (c): Chuẩn bị 0,50 g hỗn hợp các methyl ester của acid béo⁽¹⁾, với thành phần tương ứng với các acid béo cần xác định của mẫu thử theo qui định của chuyên luận riêng. Hoà tan trong heptan (TT) và pha loãng đến 50 ml với cùng dung môi. Có thể sử dụng các hỗn hợp methyl ester bán sẵn.

Điều kiện sắc ký

Cột:

Chất liệu: Silica nung chảy, thuỷ tinh hoặc thạch anh.

Kích cỡ: dài 10 – 30 m, đường kính 0,2 - 0,8 mm.

Pha tĩnh: Poly[(cyanopropyl)(methyl)][(phenyl)(methyl)] siloxan hoặc macrogol 20 000 (lớp phim dày 0,1 - 0,5 mm) hoặc một số pha tĩnh thích hợp khác.

Khí mang: khí heli dùng cho sắc ký hoặc khí hydrogen dùng cho sắc ký.

Tốc độ dòng:1,3 ml/phút (cho cột có đường kính 0,32 mm)

Tỷ lệ chia dòng: 1:100 hoặc ít hơn, tuỳ thuộc vào đường kính trong của cột sử dụng (1: 50 khi đường kính cột 0,32 mm).

Nhiệt độ:

Cột: 160 - 200 ^oC, tuỳ thuộc vào chiều dài và loại cột sử dụng (200 ^oC cho cột dài 30 m và bao bằng lớp macrogol 20 000). Nếu cần hoặc theo chỉ dẫn riêng, tăng nhiệt độ của cột với tốc độ 3 ^oC/phút từ 170 ^oC đến 230 ^oC (cho cột dùng macrogol 20 000).

Buồng tiêm: 250 ^oC.

Detector: 250 ^oC.

Phát hiện: Detector ion hoá ngọn lửa.

Thể tích tiêm: 1 ml.

Độ nhạy: Chiều cao của pic chính trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (a) từ 50% đến 70% toàn thang đo khi ghi sắc ký đồ.

Độ ổn định của hệ thống khi sử dụng hỗn hợp chuẩn trong các bảng 12.9.1 hoặc 12.9.3:

Độ phân giải: Không dưới 1,8 giữa pic methyl oleat và methyl stearat trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (a).

Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu: Không dưới 5 với pic methyl myristat trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (b).

Số đĩa lý thuyết: Không dưới 30000 tính theo pic methyl stearat trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (a)

 

Độ ổn định của hệ thống khi sử dụng hỗn hợp chuẩn trong các bảng 12.9.2

Độ phân giải: Không dưới 4,0 giữa pic methyl caprylat và methyl caprat trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (a).

Tỷ lệ tín hiệu trên nhiễu: Không dưới 5 với pic methyl caproat trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (b).

Số đĩa lý thuyết: Không dưới 15 000 tính theo pic methyl caprat trong sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (a)

 

Đánh giá sắc đồ

Tránh điều kiện thử nghiệm có chiều hướng làm che giấu pic (sự có mặt của các thành phần khác nhau rất ít về thời gian lưu, ví dụ như acid linolenic và acid arachidic).

Phân tích định tính:

Xác định các pic trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (c), các pic có thể được xác định bằng đường chuẩn với sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu (a) và thông tin ghi ở các bảng 12.9.1,  12.9.2 và 12.9.3.

a) Sử dụng điều kiện đẳng nhiệt để tính logarithm của sự biến đổi thời gian lưu như một hàm của số nguyên tử carbon trong acid béo; định tính các pic dựa trên đường thẳng lập được theo cách trên và giá trị "chiều dài chuỗi carbon tương ứng" của các pic khác nhau. Đường chuẩn của các acid béo no là một đường thẳng. Logarithm sự biến đổi thời gian lưu của các acid béo không no nằm trên đường thẳng này và có vị trí tương ứng với giá trị không nguyên của số nguyên tử carbon  được biết từ giá trị tương ứng với chiều dài chuỗi.

b) Sử dụng chương trình nhiệt độ tuyến tính để xác định thời gian lưu dựa trên số nguyên tử carbon của acid béo, định tính bằng cách so sánh với  đường chuẩn của hỗn hợp chuẩn.

Phân tích định lượng

Thông thường, sử dụng phương pháp tính phần trăm mà trong đó tổng diện tích của tất cả các pic trên sắc ký đồ ngoại trừ dung môi được tính là 100%. Hàm lượng của mỗi thành phần được tính dựa trên tỷ lệ của diện tích pic tương ứng so với tổng diện tích của tất cả các pic thu được từ mẫu đem thử. Loại bỏ các pic có diện tích nhỏ  hơn 0,05% so với tổng diện tích pic.

Trong một vài trường hợp như sự có mặt của các acid béo từ 12 nguyên tử carbon trở xuống, hệ số hiệu chỉnh có thể được sử dụng trong các chuyên luận riêng để xác định tỷ lệ phần trăm diện tích pic.

 

Phương pháp B

Phương pháp không áp dụng với các dầu béo có chứa acid béo dạng glycerid với các nhóm epoxy-, hydroepoxy-, cyclopropyl, nhóm cyclopropenyl, hoặc các dầu béo có chỉ số acid lớn hơn 2,0.

Dung dịch thử

Lấy 0,100 g chế phẩm cho vào ống ly tâm 10 ml  có nắp xoáy. Hoà tan trong 1ml heptan (TT) và 1ml dimethyl carbonat (TT), đun nóng nhẹ (50 - 60 ^oC) và lắc mạnh. Thêm 1 ml dung dịch natri (TT) 1,2 %  trong methanol khan (TT) (được pha chế hết sức cẩn thận) khi dung dịch còn ấm, trộn mạnh trong 5 phút. Thêm 3 ml nước  và trộn mạnh trong 30 giây. Ly tâm trong 15 phút với tốc độ 1500 vòng/phút. Tiêm 1 ml pha hữu cơ.

Dung dịch đối chiếu và đánh giá sắc đồ: Trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, tiến hành như miêu tả ở phương pháp A

Cột:

Chất liệu: Silica nung chảy.

Kích cỡ: Dài 30 m, đường kính 0,25  mm.

Pha tĩnh: Macrogol 20 000 (lớp phim dày 0,25 mm).

Khí mang: Khí heli dùng cho sắc ký.

Tốc độ dòng: 0,9 ml/phút

Tỷ lệ chia dòng: 1:100.

NhiÖt ®é:

 

	Thêi gian (phót)	NhiÖt ®é (0C)
	0-15	100
Cét	15-36	100®225
	36-61	225
Buång tiªm		250
Detector		250

 

Phát hiện: Detector ion hoá ngọn lửa.

Thể tích tiêm: 1 ml.

 

Phương pháp C

Phương pháp này  không áp dụng với các dầu béo có chứa acid béo dạng glycerid với các nhóm epoxy-, hydroepoxy-,aldehyd, ceton, cyclopropyl, nhóm cyclopropenyl, và kết hợp với các đa acid béo không no hay các nhóm acetylenic do các nhóm này bị phá huỷ một phần hay toàn bộ.

Dung dịch thử: Hoà tan 0,10 g mẫu thử trong 2 ml dung dịch natri hydroxyd (TT) 2 % trong methanol (TT) trong bình nón 25 ml và đun sôi hồi lưu trong 30 phút. Thêm 2,0 ml  dung dịch boro trifluorid-methanol qua ống sinh hàn và tiếp tục đun sôi trong 30 phút. Thêm 4 ml heptan (TT) qua ống sinh hàn và tiếp tục đun sôi trong 5 phút. Làm nguội, thêm 10 ml dung dịch natri clorid bão hoà (TT), lắc trong 15  giây và thêm tiếp dung dịch natri clorid bão hoà (TT) cho đến khi pha dung môi trên dâng lên đến cổ bình. Lấy 2 ml pha dung môi trên, rửa bằng nước ba lần, mỗi lần 2 ml và làm khan bằng natri sulfat khan (TT).

Dung dịch đối chiếu và đánh giá sắc đồ: Trừ khi có chỉ dẫn khác trong chuyên luận riêng, tiến hành  như miêu tả ở phương pháp A

 

B¶ng 12.9.1: Hçn hîp chuÈn ®Ó lËp ®­êng chuÈn⁽²⁾

		Tû lÖ thµnh phÇn (phÇn tr¨m kl/kl)
Thµnh phÇn hçn hîp	T­¬ng øng víi chiÒu dµi chuçi(3)	§¼ng nhiÖt	Ch­¬ng tr×nh nhiÖt ®é tuyÕn tÝnh
Methyl laurat	12,0	5	10
Methyl myristat	14,0	5	15
Methyl palmitat	16,0	10	15
Methyl stearat	18,0	20	20
Methyl arachidat	20,0	40	20
Methyl oleat	18,3	20	20

 

B¶ng 12.9.2: Hçn hîp chuÈn ®Ó lËp ®­êng chuÈn⁽²⁾

		Tû lÖ thµnh phÇn (phÇn tr¨m kl/kl)
Thµnh phÇn hçn hîp	T­¬ng øng víi chiÒu dµi chuçi(3)	§¼ng nhiÖt	Ch­¬ng tr×nh nhiÖt ®é tuyÕn tÝnh
Methyl caproat	6,0	5	10
Methyl caprylat	8,0	5	35
Methyl caprat	10,0	10	35
Methyl laurat	12,0	20	10
Methyl myristat	14,0	40	10

 

 

 

 

B¶ng 12.9.3: Hçn hîp chuÈn ®Ó lËp ®­êng chuÈn⁽²⁾

		Tû lÖ thµnh phÇn (phÇn tr¨m kl/kl)
Thµnh phÇn hçn hîp	T­¬ng øng víi chiÒu dµi chuçi(3)	§¼ng nhiÖt	Ch­¬ng tr×nh nhiÖt ®é tuyÕn tÝnh
Methyl myristat	14,0	5	15
Methyl palmitat	16,0	10	15
Methyl stearat	18,0	15	20
Methyl arachidat	20,0	20	15
Methyl oleat	18,3	20	15
Methyl eicosenoat	20,2	10	10
Methyl behenat	22,0	10	5
Methyl lignocerat	24,0	10	5

 

(1): Methyl ester cña acid bÐo ph¶i ®¹t qui ®Þnh vÒ chÊt chuÈn cña D­îc ®iÓn ViÖt Nam.

(2): Áp dông cho hÖ thèng s¾c ký khÝ víi cét mao qu¶n vµ buång tiªm chia dßng, c¸c thµnh phÇn cã m¹ch dµi nhÊt cña hçn hîp mÉu thö cÇn ®­îc thªm vµo hçn hîp chuÈn khi tiÕn hµnh ph©n tÝch ®Þnh l­îng sö dông ®­êng chuÈn.

(3): Gi¸ trÞ ®­îc tÝnh dùa trªn ®­êng chuÈn víi cét macrogol 20000.